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冷凍干燥與液氮保藏菌種技術(shù)

點(diǎn)擊次數(shù):2277 更新時(shí)間:2018-01-19
 建議用下列方法恢復(fù)培養(yǎng)冷凍干燥保藏的菌種。

一、安瓶管開(kāi)封 :

1.用浸過(guò)70%酒精的脫脂棉擦凈安瓿管。

2.用火焰將安瓿管頂端加熱。

3.滴無(wú)菌水至加熱的安瓿管頂端使玻璃開(kāi)裂。

4.用挫刀或鑷子敲下已開(kāi)裂的安瓿管的頂端。

二、菌株恢復(fù)培養(yǎng) :

1.用無(wú)菌吸管,吸取0.3~0.5ml適宜的液體培養(yǎng)基,滴人安瓿管內(nèi),輕輕振蕩,使凍于菌體溶解呈懸浮狀。

2.取0.1~0.2ml菌體懸浮液,移植于適宜的瓊脂斜面/平板培養(yǎng)基上,剩余的菌液,注入適宜的液體培養(yǎng)基內(nèi),然后在建議的溫度下培養(yǎng)。

3.若未能活化,或活化后有疑問(wèn)時(shí),請(qǐng)于收到菌種1個(gè)月內(nèi),通知保藏中心,經(jīng)查證無(wú)誤后,即免費(fèi)補(bǔ)寄。

三、注意事項(xiàng) :

1.菌種活化前,請(qǐng)將安瓿管保存在6一10℃的環(huán)境下。

2.厭氧菌的培養(yǎng),如無(wú)特別說(shuō)明,自開(kāi)封至接種完成,均需以無(wú)氧氣體充填,以保持厭氧狀態(tài)。

3.某些菌種經(jīng)過(guò)冷凍干燥保存后,延遲期較長(zhǎng),需連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長(zhǎng),此時(shí)請(qǐng)將步驟二(2)重復(fù)一次。

< 液氮超低溫保藏程序 >

1、容器的選擇:使用帶螺旋蓋的2ml塑料安培瓶。

2、檢查安培瓶是否滲漏:用0.05%的亞甲基藍(lán)水溶液在4℃浸泡30-45分鐘,沖洗干凈,棄去含有藍(lán)色染料的安培瓶,其余的安培瓶備用。

3、打印標(biāo)簽(激光打印)。

4、容器的滅菌:先用蒸餾水漂洗干凈安培瓶,再用蒸餾水在滅菌鍋中121℃浸泡滅菌15分鐘,干燥并將打印好的標(biāo)簽放入安培瓶中,略擰緊螺旋蓋,再行121℃滅菌30分鐘。

5、保藏菌菌齡:處于zui大生長(zhǎng)量階段或?qū)?shù)生長(zhǎng)期后期。

6、保護(hù)劑:選用5-10%的甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑。

1)甘油的準(zhǔn)備:在121℃滅菌15分鐘,2-8℃貯存。甘油一般以兩倍zui終所需濃度的水溶液保存,然后與同等量的細(xì)胞懸液混合。若不用細(xì)胞懸液,則以zui終所需濃度的水溶液保存。

2)二甲基亞砜:用0.22um的聚四氟乙烯過(guò)濾膜過(guò)濾除菌。過(guò)濾膜預(yù)先用甲醇和二甲基亞砜漂洗。無(wú)菌的二甲基亞砜以10-15ml裝量2-8℃避光保存。

7、分裝:在無(wú)菌條件下,將細(xì)胞懸液(從平板上打下直徑為5cm的菌塊)分裝于安培瓶中,并注入保護(hù)劑,擰緊螺旋蓋。 傳代細(xì)胞

8、將安培瓶固定在鋁夾上,貼好標(biāo)簽。為了便于取用,一般一個(gè)鋁夾上僅放一個(gè)菌株。

9、將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4℃,再將鋁夾放入其中。以每分鐘1℃降溫至-40℃,然后以每分鐘10℃降溫至-90℃。降溫以后,將鋁夾轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲(chǔ)存器中保存。

10、菌種的復(fù)活:將液氮保藏的菌種取出,迅速放入37℃水浴中解凍。一般需2至2.5分鐘,等*解凍后,再及時(shí)轉(zhuǎn)接到合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 

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